Nüve Forum

Nüve Forum > akademik > Veterinerlik Fakültesi > Protein Saflaştırılmas ile İlgili Bazı metotlar

Veterinerlik Fakültesi hakkinda Protein Saflaştırılmas ile İlgili Bazı metotlar ile ilgili bilgiler


Protein Saflaştırılmas ile İlgili Bazı metotlar-Some methods about protein purification Özet: Yüzyılımızda ;kimya ,ilaç,gıda ve biyoloji ve onların alt birimlerinde en çok kullanılan metotlardan biridir.Bu çalışmada protein saflaştırılması ve onun

Veterinerlik Fakültesi Anatomi, Histoloji, Embriyoloji, Fizyoloji, Biyokimya, Mikrobiyoloji, Parazitoloji, Patoloji, Farmakoloji ve Toksikoloji, İç Hastalıklar, Cerrahi, Doğum ve Jinekoloji, Veteriner Hekimliği, Hastalıklar ve Klinikler Bilimler , Zootekni ve Hayvan Besleme, Döllenme ve Suni Tohumlama, Besin Hijyeni ve Teknolojisi dersleri, Zootekni, Hayvan Besleme ve Besleme Hastalıkları dersleri okutulur

Cevapla

 

LinkBack Seçenekler Stil
  #1  
Alt 24.07.08, 20:40
Ayça Şallı - ait kullanıcı resmi (Avatar)
Yaratıcı
 
Üyelik tarihi: Dec 2006
İletiler: 1.393
Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.
Standart Protein Saflaştırılmas ile İlgili Bazı metotlar

Protein Saflaştırılmas ile İlgili Bazı metotlar-Some methods about protein purification

Özet: Yüzyılımızda ;kimya ,ilaç,gıda ve biyoloji ve onların alt birimlerinde en çok kullanılan metotlardan biridir.Bu çalışmada protein saflaştırılması ve onun problemlerinden bahsedilmektedir.Hedefimiz sonuçta ucuz ve çok ürün elde etmektir.Bu amaç içinde çok dikkat edilmelidir.

Summary: İn this century ;in the field of chemistry ,drugs, foods, and biology
and their subdivisions one of the most usefull method is purification .In this study it was explained about protein purification and its problems.Our target is more and cheapear products to gain at the final work.For this work we have to pay attention to the activity of the protein.

Giriş
Günümüzde ilaç ve gıda sanayiinde ve bunlara bağlı diğer kollarda protein saflaştırılması son yıllardaki en popüler çalışma metotlarından biridir. Protein saflaştırılması beraberinde birçok spesifik problem getirir (Otoliz, denatürasyon, aktivite kaybı gibi).Zaman ve giderler ideal bir saflaştırma şeması oluşturmaya tam anlamı ile yetmemektedir. Çalışmadaki ana hedeflerden ilki, saflaştırılacak moleküle en uygun metotları seçerek ideal bir prosedür geliştirmektir(1,2,6,8,16,20,24).
Saflaştırmada ,başlangıçtaki materyalden mümkün olduğunca çok ürün elde etmeye çalışılır. Bu konuda dikkate alınması gereken iki özellik vardır:
1-Saflığın derecesi ,2-ürünün miktarı ve aktivitesi. Aktif olmayan ürün kullanım amacı bulamayacaktır.Hedefler tespit edildikten sonra çalışmaya başlanır(2,6,8,10,16,20,22,24,34).
Çalışmada seçilecek metotlar proteinin fiziksel,kimyasal ve biyolojik özelliklerine bağlıdır.
Protein saflaştırılmasında çalışmaya başlayabilmek için öncelikle şu aletlere ihtiyaç vardır : Hassas terazi, metre,manyetik karıştırıcı,soğuk oda, kromatografi cihazları,derin dondurucular (-4,-800 C arası),250-900 m arası okuma yapabilen spektrofotometre, ELISA mini okuyucu,elektroforez kabini,HPLC ekipmanı, liyofilizatör, UV monitör, mikserler,homojenizatör,masa tipi santrifüj, ultrasantrifüj, fraksiyonlama aleti(kolon kromatografi için),kimyasal malzemeler ve tampon çözeltiler(2,6,7,8,9,22,24,30,31).
Proteinin fiziksel, kimyasal ve biyolojik özellikleri belirlenir. Bu bilgilere önceden sahip olmak çalışmada seçilecek metotlar açısından çok büyük kolaylık sağlar(2,6,8,10,16,20,22,24).
Saflaştırılmada kullanılan ana materyal ile elde edildiği hücre,doku ve organın bitkisel veya hayvansal olması ,saflaştırma sonunda elde edilen ürünün miktarı üzerine ve uygulanacak metotların isabetliliğine, dolayısı ile harcanacak zaman ve giderler için çok önemlidir. Bunlar içerisinde enzimleri; özellikle organizmada belirli dokularca üretilen ve az olan enzimleri saflaştırmak epeyce güçtür.


__________________

Güzel Sanatlar Fakültesi/Lisesi Yetenek Sınavlarına Hazırlık Kursu
Resim Yağlı Boya Hobi Kursu
Hızlı ve Etkili Okuma Kursu
Çocuklar için Hızlı Okuma Kursu
Çocuklar için Resim Kursu
Diksiyon Kursu
Nefes Teknikleri Kursu
Kişisel Gelişim Kursları
Alıntı ile Cevapla
  #2  
Alt 24.07.08, 20:42
Ayça Şallı - ait kullanıcı resmi (Avatar)
Yaratıcı
 
Üyelik tarihi: Dec 2006
İletiler: 1.393
Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.
Standart Protein Saflaştırılmas ile İlgili Bazı metotlar

Yöntemler
A. Materyalin hazırlanması
B. Materyalin stabilizasyonu
C. Materyalin konsantriyasyonu
D. Materyalin izolasyonu ve saflaştırılması,elde edilen üründe moleküller ağırlık
tayini ve karakter tespiti.
A. Materyalin hazırlanması
Materyalin hazırlanmasında materyalin elde edildiği orijine göre metot seçilir. Burada uygulanacak fiziksel ,kimyasal ve biyolojik işlemler proteinin orijinine bağlıdır.
Sıvılaştırma:
Proteinin saflaştırılması için gerekli birinci koşuldur. İzolasyon koşullarına göre sadece sıvılaştırılmış materyal kullanılır(1,2,5,6,8,15,17,20,22,24,28,31,34).
Sıvılaştırmada kullanılan çözeltiler hücreleri parçalayıp,açarak içerlerindeki proteinlerin dışarı çıkmasını sağlarlar. Saflaştırılacak protein subselüler organeller de olabilirler .Örneğin protein mitakondride lokalize olmuşsa öncelikle mitakondrinin izole edilmesi gerekir. Daha sonra protein çözündürülerek bu organelden ayrılır(1,2,6,8,22,28,30,34).
Yapılan çalışmada materyale ve uygulanan metotlara göre çözünmüş madde miktarı mg ve kg düzeylerinde olabileceği gibi,sanayideki gibi tonlarca da olabilir(1,3,7,22,30,31,32,34).
Ozmotik lizis:
Hücreleri parçalayıp açmak için kullanılan metotlardan biridir. Bu metot hücreyi hipotonik bir ortama alıp içeriğin ortama geçmesinden sonra içeriği pipetlemek suretiyle olur.Hücre duvarında yüksek oranda karbonhidrat içeren bakteriler,bitkiler ve mantarlar için uygun bir yöntem değildir(1,3,4,5,7,10,11,12,22,23,25,27,28,29).
Ezme:
Ezme işlemi saflaştırmada en ilk ve en çok uygulanan metottur. Basit anlamda havan,manuel veya elektrikli homejenizatörlerle yapılır(2,4,8,10,11,22,24,25,28,31).
Bu işlem genellikle mitakondri,lizozom gibi hücre içi organelleri açığa çıkarmak için kullanılır. Ezme işleminden sonra sıvı kolayca çözünür hale gelir(1,2,6,8,20,22,26,28,29,31).
Kuru materyalle çalışırken (maya,bitki gibi) parçalayıcı içerisine buz ilave ederek sürtünmeden doğan ısınma ve yanmaya karşı önlem alınmış olur. Ezme işleminde en çok homojenizatörler ile mutfak tipi parçalayıcılar kullanılırlar. Pres veya ultrasonik dalgalar da ezme işleminde kullanılabilirler(4,10,16).
Bu işlemlere başlamak için materyalin sıvılaştırılması gerekir. Sıvılaştırılmış materyal ile yapılacak fiziksel ve kimyasal işlemler daha kolay olur. Materyali sıvılaştırmak için tampon çözeltilere ihtiyaç vardır En çok kullanılan tampon çözeltiler şunlardır(2,4,7,9,10,22,25,31,32):
Tablo 1. Materyali Sıvılaştırmak İçin En Çok Kullanılan Tampon Çözeltiler pH değeri --- asit ve bazlar
1.0-2.2 HCL/KCL
2.2-3.6 Glisin/HCL
2.6-7.6 Na2HPO4/sitrik asit
3.0-6.2 Sitrik asit/NaOH
3.7-5.6 Asetik asit /NaOH veya Sodyum asetat
5.8-8.0 NaH2PO3/Na2HPO4
5.8-9.5 Bis.Tris/HCL
6.3-9.5 Bis.Tris propan/HCL
6.8-8.6 Trietonalamin hidroklorid/NaOH
7.0-9.0 Tris/HCL
8.0-10.0 Dietonalamin
8.1-9.0 Sodyumborat/HCL
8.6-10.6 Glisin/NaOH
9.0-10.7 Sodyumkarbonat/sodyum bikarbonat
9.3-10.7 Sodyumborat/NaOH
11.0-11.9 Na2HPO4/NaOH

*Cooper,Terrance.G. (6)
Bu tür tamponlar çok çabuk bozulurlar. Koruyucu olarak EDTA veya 2-merkaptoetanol ilave ederek dayanıklılık süresi arttırılır. Tampon çözeltilerde pH ısıya göre değişim gösterirler. Hazırlanırken kullanıldıkları ortam ve ısı göz önüne alınır. Tampon çözeltiler normal konsantrasyonlarının 10-100 katı oranlarda hazırlanır ve stoklanırlar. Gerekli durumda bu stoklardan kullanılır(1,2,3,4,6,7,9,10 ).


__________________

Güzel Sanatlar Fakültesi/Lisesi Yetenek Sınavlarına Hazırlık Kursu
Resim Yağlı Boya Hobi Kursu
Hızlı ve Etkili Okuma Kursu
Çocuklar için Hızlı Okuma Kursu
Çocuklar için Resim Kursu
Diksiyon Kursu
Nefes Teknikleri Kursu
Kişisel Gelişim Kursları
Alıntı ile Cevapla
  #3  
Alt 24.07.08, 20:49
Ayça Şallı - ait kullanıcı resmi (Avatar)
Yaratıcı
 
Üyelik tarihi: Dec 2006
İletiler: 1.393
Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.
Standart Protein Saflaştırılmas ile İlgili Bazı metotlar

B. Stabilizasyon:
Protein saflaştırmada en hassas konu , proteinin aktivitesinin korunmasıdır. Aktivite kaybı önlenemez ise elde edilecek ürün miktarı da o kadar azalır. Önemli olan nokta , en son basamakta daha fazla aktif protein elde etmektir. Her basamakta stabilizasyon kuralları tekrar yerine getirilmelidir. Özellikle enzim proteinleri ile çalışırken buna daha çok dikkat etmek gerekir(7,20,22,28,31,32).

Stabilizasyonu sağlayan fiziksel ve kimyasal faktörler aşağıdaki gibi sıralanabilirler :
a. pH
b. Oksidasyon derecesi
c. Ağır metal konsantrasyonu
d. Polarite
e. Proteaz ve nükleazların konsantrasyonu
f. Isı
g. Saflaştırmada başlangıçtan sona kadar geçen süre
h. Elde edilecek ürünün ortamdaki konsantrasyonu


C.Konsantriye edilmesi
Saflaştırılacak proteinin fiziksel ve kimyasal özelliklerini bilmek, metotlarda kullanılacak maddelerin seçimi için kolaylık olur.
Kolon kromotografilerinde , kolonun çapını dar tutmak fraksiyonlama işlemini daha da kolaylaştırır. Bunun için materyalin konsantriye edilmesi gerekir.
Konsantrasyonu arttırmak için fiziksel ve kimyasal metotlar uygulanır.

Başlangıç materyalinin hacmi ne kadar az ve konsantrasyonu ne kadar fazla olursa çalışma da o kadar kolay yürütülür. Materyalin konsantriye edilmesi için şu metotlar uygulanabilir.
a.Ayırıcı protein çökeltme
b.Ultrafiltrasyon
c.Dializ
d.Polietilenglikol ile hacmin daraltılması

Tablo 2.Ayırıcı protein çökeltilmesi ile ilgili örnek tablo
---------------------------------------Civciv serumu----Tuz/pH Çökeltilmesi
Spesifikaktivite aktivite------------------10.1 mU/mg--------350 mU/mg
/protein (mU/mg)
Saflaştırma faktörü--------------------------1------------------35
Ürün eldesi------------------------------% 100--------------% 60

*Treskatis.Sven.,(31)

Bu tablodan da anlaşıldığı gibi protein miktarı azalmış,hacim küçültülmüş fakat toplam aktivite artırılmıştır. Bu işlem yapılırken , için farklı konsantrasyonlardaki tuz çözeltileri ilave edilerek pH değiştirilmiş ortamdaki diğer proteinlerin çökelmesi sağlanmıştır. Ayırıcı protein çökeltme için örnek bir tablodur(9,10,11,16,32).
Polietilenglikollerde , aşırı su çekme özelliklerinden dolayı , hacmi çok olan materyallerin yoğun PEG çözeltisi içerisinde dialize ederek buna benzer bir işlem yaparız. Dializ ve ultrafiltrasyon metotlatrı da prensipte hacmi daraltmaya dayanırlar(2,3,7,23,25,32).
Konsantriye edilen materyal artık izolasyon ve saflaştırma işlemine alınabilir.


__________________

Güzel Sanatlar Fakültesi/Lisesi Yetenek Sınavlarına Hazırlık Kursu
Resim Yağlı Boya Hobi Kursu
Hızlı ve Etkili Okuma Kursu
Çocuklar için Hızlı Okuma Kursu
Çocuklar için Resim Kursu
Diksiyon Kursu
Nefes Teknikleri Kursu
Kişisel Gelişim Kursları
Alıntı ile Cevapla
  #4  
Alt 24.07.08, 20:54
Ayça Şallı - ait kullanıcı resmi (Avatar)
Yaratıcı
 
Üyelik tarihi: Dec 2006
İletiler: 1.393
Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.Ayça Şallı için ne kadar gurur duyulsa azdır.
Standart Protein Saflaştırılmas ile İlgili Bazı metotlar

D. İzolasyon ve saflaştırma:
İzolasyon ve saflaştırma işleminde protein miktarı ölçmeye yarayan çok iyi bir metoda ihtiyaç vardır. Protein testi için eldeki imkanlar dahilinde, Biüret,Lowry veya UV 280 nm dalga boyunda bir spektrofotometre ile doğrudan ölçülebilir. Ucuzluğu ve hızlı olması çok büyük avantaj sağlamaktadır(2,6,7,14,16,22,23,32).
Proteinin anyonik veya katyonik özelliklerine bağlı olarak kromatografi işlemine başlanır (2,8).
Kromatografide, proteinin fiziksel özelliklerine bağlı olarak ortamdaki diğer proteinlerden ve yabancı maddelerden ayırt edilmesi amaçlanır(25).Moleküler ağırlığına bağlı olarak protein kolonlardan filtre edilir. Burada kullanılan matriksleri seçerken , proteinin moleküler ağırlığı ayırt edici bir kolaylık sağlar. Saflaştırmada

kullanılan iyon değişim ve affinite kromatografileri proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre seçilmelidir. Her bir basamakda, elde edilen ürünün hacmi daralır ve çalışmamız kolaylaşır(2,8,11,12,17,20,22,25,32).
Burada dikkat edilmesi gereken husus aktivite kaybıdır. Saflaştırılan protein azalacağı için ortamda birbirlerine bağlanarak kolayca çökebilirler. Bunu engellemek için ortama farklı moleküler ağırlıkta olan ve aktiviteyi bozmayacak şekilde yoğun protein ilavesi yapılabilir. Her basamakta sodyum dodesilsülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS PAGE) uygulaması yapılarak proteinin moleküler ağırlığı ve miktarı tespit edilir. Jel elektroforezi 1,2,3 boyutlu olarak uygulanabilir. Böylece ortamdaki diğer proteinlerin varlığı tespit edilir(1,2,6,8,9,13,18,20,22,23,25,28).
Saflaştırma işlemlerinde , proteinin moleküler ağırlığına bağlı olmak koşuluyla farklı yoğunluk ortamı meydana getirerek gradient santrifüj tekniği uygulaması ile hem ayırıcı santrifüj yapılır ve hem de moleküler ağırlık tayini yapılır. Rotofor ile fiziksel özelliğine bağlı olarak protein fraksiyonlaması yapılır. Proteinin izoelektrik noktası da ayırt edici metotlardan biridir. Bu işlemler uygulanırken en çok yapılan işlemlerden biri dikkat edildiği gibi santrifüjdür. Santrifüj tekniği ile protein fraksiyonlanması,gradient santrifüj,çökeltme gibi metotlar uygulanır. Gradient santrifüj için en çok değişik konsantrasyonlardaki sakkaroz çözeltileri kullanılmaktadır(9,11,14,15,20,24,26,32).
Moleküler ağırlık tayini için elekroforez ve gradient santrifüj ile beraber yüksek basınçlı likit kromatografisi (HPLC) uygulaması da yapılabilir. Bu metot moleküler ağırlık tayininde en çok kullanılan metottur ve alete yüksek verimli anyonik (MonoQ gibi) kolonlar takılarak yapılır. Standart ve kolonlarının pahalılığı kullanılacak malzemeler için zorluk oluşturabilir. Amacımız en ucuz yolla ve en çok ürünü elde etmektir(1,2,10,12,18,20,22,27,28,34
Elde edilen protein amaca yönelik olarak ardışıklık(sekvenzasyon) testine tabi tutulur. Bu testte amaç, proteindeki amino astlerin ardışıklığını tespit etmektir. Böylece saflaştırılan protein diğer çalışmalar için karakterize edilmiş olarak elde edilir (2,5,10,11,12,18,19,20,21,27,30).
Bu işlemler yapılırken uygulanan metotları şöyle şematize edebiliriz.
a. Anyon,katyon değişim kromatografisi
b. Absorbsiyon kromatografisi
c. Affinite kromatografisi
d. Sakkaroz gradient santrifüj tekniği
e. Rotofor ile fraksiyonlama
f. Elektroforez(SDS- PAGE)
g. Elektrofokussing
h. Moleküler eleme teknikleri
l. Ayırıcı çözünürlük
m.Yüksek basınç likit kromatografisi(HPLC)
n. Protein ardışıklılığı(Sekvenzasyon)


*Gaustad,Rolf.,(11)
Saflaştırmanın kriteri , oluşturulan yöntem sonucu elde edilen üründür. En son ürün ne kadar saf ve çok ise yöntemi o kadar başarılı kabul edebiliriz. Kullanılan malzeme ve giderler sonucu ekonomik olup olmadığını kontrol ederiz .En ekonomik ve en hızlı olan yöntemler seçilerek protein saflaştırma prosedürü sabitleştirilir ve ilerkii çalışmalarla daha da iyileştirilir.




KaynakPDF
Eklenmiş Resim
Dosya tipi: jpg tablo3.JPG (49,2 KB (Kilobyte), 1471x kez indirilmiştir)
Eklenmiş Dosya
Dosya tipi: pdf Makale-12.pdf (69,4 KB (Kilobyte), 70x kez indirilmiştir)
__________________

Güzel Sanatlar Fakültesi/Lisesi Yetenek Sınavlarına Hazırlık Kursu
Resim Yağlı Boya Hobi Kursu
Hızlı ve Etkili Okuma Kursu
Çocuklar için Hızlı Okuma Kursu
Çocuklar için Resim Kursu
Diksiyon Kursu
Nefes Teknikleri Kursu
Kişisel Gelişim Kursları
Alıntı ile Cevapla
Cevapla

Tags
metotlar, protein, saflaştırılmas, ılgili

Seçenekler
Stil

Yetkileriniz
You may not post new threads
You may not post replies
You may not post attachments
You may not edit your posts

BB code is Açık
[IMG] Kodları Açık
HTML-KodlarıKapalı
Trackbacks are Açık
Pingbacks are Açık
Refbacks are Açık



Bütün zaman ayarları WEZ +2 olarak düzenlenmiştir. Şu anki saat: 03:18 .