Hemofili Moleküler Genetiği

CiwCiw · #1 27.04.08, 22:45

Hemofili Moleküler Genetiği

Hemofili kan pıhtılaşmasında rol alan proteinlerden
Faktör VIII (FVIII) ve Faktör IX
(FIX)’dan birinin eksikliği veya bozukluğu
ile ortaya çıkan X kromozomuna bağlı resesif geçiş
gösteren tek gene bağlı kalıtsal bir hastalıktır.
Spontan veya çeşitli etkenler sonucu meydana
gelen kanamaların sıklığı hastalığın klinik şiddetini
(fenotipini) ağır, orta veya hafif hemofili olarak
belirler. Hemofilinin iki tipi vardır. Hemofili A,
yaklaşık her 5000 erkek doğumda rastlanan faktör
VIII (FVIII) eksikliği veya bozukluğu, hemofili B
ise yaklaşık her 10,000 erkek doğumda rastlanan
faktör IX (FIX) eksikliği veya bozukluğudur. Her iki
faktörü kodlayan genlerin X kromozomu üzerine
haritalanması ve DNA dizisinin çıkarılması 1984/
85 yıllarına rastlar. Özellikle FVIII’in büyük ve karmaşık
genlerden biri olmasına rağmen haritalanması
ve ekzon dizilerinin bilinmesi sayesinde bu
genler moleküler patolojisi sıklıkla çalışılan ve DNA
analizine dayalı tanı yöntemlerinin ilk uygulandığı
genler arasındadır. Hemofilinin dişilerde görülmesi
X-inaktivasyonuna veya nadiren iki defektif allelin
kalıtılmasına bağlıdır. Hastalığın genotipi FVIII
ve FIX genlerinde meydana gelen mutasyonların
saptanması ile belirlenir. Hastalığın oluşumu 1/3
oranında sporadik olarak görülür. Bu durumda
mutasyon annenin gametlerinden birinde oluşmuştur.
Ailede bir tek hasta birey vardır ve anne
taşıyıcı değildir. Ailesel geçişli hemofilide ise hastalık
ailede birden çok bireyde görülür ve hastanın
annesi taşıyıcı durumdadır (1).
Hastaların yaklaşık % 15-25’inde FVIII aktivitesini
düşüren antikorlar oluşur. Bu oran hemofili
B’de %4-5’dir. Nadiren CRMred veya CRM+
hastalarda görülür (low responders). Genellikle
CRM- hastalarda büyük delesyon veya anlamsız
mutasyon taşıyanlarda görülür (high responders).
Ancak, inhibitörlerin oluşumu sadece mutasyon
tipine değil aynı zamanda MHC antijenlerinde de
bağlıdır. FVIII’in A2, A3 ve C2 bölgesindeki epitoplar
antikor oluşumunda önemlidir. İnhibitor
oluşumu replasman tedavisinde olduğu kadar
gen tedavisi protokolleri içinde önemli bir sorun
oluşturur (2).
1984’den beri yaklaşık 2500 hemofili A hastasında
hemofilinin moleküler temeli gen yapısı düzeyinde
incelenmiştir ve mutasyonlar sürekli güncellenen
bir veritabanında tutulmaktadır . Hemofili A veritabanında
821 hasta girişi vardır. Bunlardan 43 tanesi Türk
hastalarında saptanan mutasyonlardır. Hemofili B
veritabanında ise 2511 hasta girişinden 44
tanesi Türk hastalarına aittir.

Amaç
Hemofilide genetik çalışmaların amaçlarını hastalığa
yol açan mutasyonları belirleyerek genotip/
fenotip ilişkisini kurmak; hasta ailelerine genetik
danışma sunmak için uygun DNA bağlantı analizi
yöntemlerini belirlemek; hemofili mutasyonlarının
profili çıkarmak için veritabanı oluşturmak;
mutasyon profilinin farklı toplumlarda karşılaştırmalı
analizini yapmak; mutasyon mekanizmalarını
incelemek ve FVIII/FIX genlerini model sistemler
olarak kullanarak bazı temel genetik kavramları
açıklamak olarak sıralayabiliriz. Türkiye’de
hemofili genetiği çalışmaları 1988/89 yıllarında
Boğaziçi Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik
Bölümü ile Hacettepe ve Cerrahpaşa Tıp Fakülteleri
Hematoloji Kliniklerinin ortaklaşa çalışması ile
başlatılmıştır.Hemofili genetiği çalışmaları için DNA örnekleri
10ml EDTA’lı tüplere alınan kan örneklerinden
elde edilmektedir. Kan örneklerinin tercihen bir
gün içinde (sıcak havada buz içinde) DNA çıkarılacak
merkeze ulaştırılması gerekmektedir. Kan
örnekleri DNA çıkarılmadan saklanacaksa 40C
de 1 hafta, -20oC de ise aylarca saklanabilir. DNA
örnekleri ise yıllarca saklanabilir.

» Nüve Forum » akademik » Fen Edebiyat Fakültesi » Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

CiwCiw · #2 27.04.08, 22:46

FVIII/FIX Gen Yapıları ve Mutasyon Belirleme Yöntemleri

FVIII geni X kromozomunun uzun kolu üzerinde
telomere 1Mb uzaklıkta Xq28 bölgesindedir.
186 kb DNA üzerinde 26 ezondan oluşur,mRNA’sı
9 Kb’dir. En büyük intron, 32.4 kb uzunluğunda
olan intron 22dir. Bu intronda görevi bilinmeyen
1.8 kb transkript yapan F8A geni bulunur. F8B
geni aynı promotordan ters yönde ve FVIII ezon
23-26’yı da içine alarak sentezlenir. F8A’nın iki
kopyası telomer ucuna doğru 400 kb uzaklıktadır.
F8A homologları arasındaki intrakromozomal
rekombinasyon ağır hemofiliye yol açar. FIX geni
ise 34 Kb uzunluğundadır ve 8 eksondan oluşur.
mRNA’sı ise 2Kb’dir.
Her iki gende nokta mutasyonları ya DGGE,
SSCP gibi hızlı gen trama yöntemleri ile veya doğrudan
PCR ve DNA dizi analizi ile belirlenebilmektedir.
Büyük genomik değişiklikler ise Southern
blot veya özel PCR yöntemleri ile saptanabilmektedir.
Türkiye’de, hemofili hastalığına yol açan
mutasyonlar klinik bulguların (ör.faktör düzeyleri,
inhibitor oluşumu ) ışığında belirli bir strateji izlenerek
yaklaşık 2-3 ay içinde saptanabilmektedir.

CiwCiw · #3 27.04.08, 22:48

Hemofili A’nın moleküler patolojisi Genomik değişiklikler

Ağır hastaların %40’ında FVIII intron-22 inversiyon
mutasyonu, %2-5’inde ise intron-1 inversiyon
mutasyonu görülür. Inversiyonlar neredeyse
tamamen erkek gametlerde meydana geldiği için
hasta annelerinin hepsi taşıyıcı durumdadır. İnhibitör
oluşumu önemli ölçüde yüksektir.
Delesyon ve insersiyonlar
En az 92 büyük delesyon rapor edilmiştir. Bunlardan
hiç biri birbirinin tekrarı değildir, dolayısıyla
FVIII geninin herhangi bir bölgesinin delesyon
ve insersiyonlara hassas olmadığı görülmektedir.
Üç orta şiddette hemofilisi olan hastada ekzon
22 veya ezon 23-24 delesyonu görülmüştür. Bu
hastaların fenotipi delesyona uğrayan ezonların
etrafında kırpılmanın normal (in-frame) olması
ve kısmi işlevi olan FVIII salgılanması ile açıklanmaktadır.
FVIII delesyonu olan hastaların yaklaşık
%38’inde inhibitor oluşumuna rastlanmaktadır.
En az 64 farklı küçük delesyon rapor edilmiştir.
Bunların çoğu kodon kaymasına sebep olduğu için
translasyonun erken sonlanmasına neden olmaktadır
7/49’unda inhibitor oluşumuna rastlanmıştır.
Delesyon “hot spot” 9A tekrarı olan bölgede
(kodon 1191-1194) görülmektedir.
28 ağır hemofili hastasında 1-13 bp’lik insersiyonlara
rastlanmıştır. Bu hastalarda bir tanesi
dışında inhibitor oluşumuna rastlanmamıştır. İki
ailede LINE-1 elementinin insersiyonunun ağır
hemofiliye yol açtığı saptanmıştır.

Nokta Mutasyonları

Hemofili mutasyon veritabanında 821 hastada
en az 553 nükleotid değişimi rapor edilmektedir.
Bunlardan 44 tanesi kırpılma bölgesi, 75 anlamsız
ve 434 yanlış anlamlı mutasyonlardır. Anlamsız
mutasyon taşıyan hastaların ikisi hariç (ezon skipping)
hepsinde ağır fenotip görülmektedir. Yakla;ik
%45’inde inhibitör oluşumu vardır. Kırpılma bölgesinde
mutasyon taşıyan hastaların hiç birinde inhibitör
oluşumuna rastlanmazken, bu oran yanlış
anlamlı mutasyon taşıyan hastalarda %2 dir.
Yanlış anlamlı mutasyon taşıyan hastaların
yaklaşık yarısında hafif ve orta şiddette hemofili
görülür çünkü büyük olasılıkla bu hastalarda
FVIII proteini normal miktarda bulunur ancak
değişik işlevsel bozuklukları içerir. Bazı durumlarda
CRM+ veya CRMred hemofili fenotipinin yapıişlev
ilişkisi bilinmektedir. Örneğin Arg 372/1689
His/Cys değişimleri trombin aktivasyonu önler
ve hafif-ağır hemofiliye yol açabilir. Tyr 1680 Phe
fenotipinde düşük FVIII miktarı tirozin sülfatlanması
olmadığından vWF bağlanması bozulması ve
FVIII stabilitesinin düşmesi ile açıklanır.
Nokta mutasyonlarının %45’i, 69 CpG dinükleotidinin
olduğu yerde oluşan C>T transisyonlarıdır.
Başka birçok gende olduğu gibi FVIII geninde
de CG dinükleotidleri mutasyon “hot spot”larını
oluşturur. Aynı mutasyon birbirinden bağımsız
olarak farklı hastalarda tekrarlanabilir.
Hemofili A mutasyonlarının orijinleri mutasyon
tipine bağlı olarak değişmektedir. Nokta mutasyonlar
erkek gametlerde 5-10 kat fazla görülmesine rağ men delesyonlar dişi gametlerde 5 kat fazla görülür.
Ortalama erkek/dişi mutasyon oranı 3.6 dır.
Türk hastalarında hemofili A mutasyon profili
veritabanı ile karşılaştırıldığında nokta mutasyonlarının
daha yüksek, büyük delesyonların ise daha
düşük olduğu görülmektedir.
Hemofili A’nın moleküler patolojisi çalışılmadan
önce kalıtsal FVIII eksikliğinin otozomal çekinik
kalıtım gösteren ağır von Willebrand hastalığı,
von Willebrand Tip 2N (Normandy) veya kombine
FV ve FVIII eksikliğinden ayırd edilmiş olması
önemlidir.

CiwCiw · #4 27.04.08, 22:49

Hemofili B’nin Moleküler Patolojisi

Nokta mutasyonları, delesyon ve insersiyonlar
başlıca mutasyon tipleridir. Mutasyonlara poly(A)
eklenme bölgesi dışında genin bütün yapısal elementlerinde
rastlanmaktadır. Ancak, Ca bağlama ve
katalitik bölgede daha sık, prepeptid ve aktivasyon
peptidinde daha az görülür. Hastaların yaklaşık %50
sinde FIX antijeni bulunmaz (CRM-). CRM- hemofili
B’ye yol açan mutasyonlar arasında büyük delesyonlar,
kodon kaymaları ve anlamsız mutasyonlar
bulunmaktadır. CpG dinükleotidleri mutasyon “hot
spot”larıdır. Muyasyonlar genellikle aileye özgüdür
ancak bir kısmında “founder effect” görülür.
Hemofili B veritabanında 2511 hasta girişi arasında
896 farklı mutasyon görülmektedir. Bunların
%71’i nokta mutasyonları, %20’si büyük delesyonlar
ve %9’u küçük delesyon/insersiyonlardır.
Türk hastalarında nokta mutasyonları %91,
büyük delesyonlar %4.5, küçük delesyonlar ise
%4.5 oranında görülmektedir.

CiwCiw · #5 27.04.08, 22:51

Doğum Öncesi Tanı ve Taşıyıcıların Belirlenmesi

Taşıyıcı belirlemesi ve doğum öncesi tanı
amaçlı hemofili A genetik analizi, genellikle, FVIII
geninde veya yakınında bulunan DNA dizi polimorfizmlerinin
kullanılmasına dayanmaktadır.
Son yıllarda ise ailelerin erken bilinçlendirilmesine
ve moleküler genetik yöntemlerindeki gelişmelere
bağlı olarak hemofili taşıyıcılarının belirlenmesi
ve doğum öncesi tanı doğrudan hastalığa yol açan
mutasyonun saptanmasına dayandırılmaktadır.
Hastalığa yol açan mutasyonun saptanabildiği
durumda taşıyıcı ve doğum öncesi tanı kesinlik
kazanır. Inversiyon mutasyonlarının analizi ağır
hemofilide %40 kesin tanı olanağı sağlamaktadır.
Mutasyon bilinmiyorsa FVIII geninin intronik
bölgelerinde bulunan 11, ezonlarda bulunan 14
dizi polimorfizmi tanı için kullanılabilir. Bir markörün
kullanılabilmesi için aile ağacında heterozigot
bir hasta annesinin bulunması şarttır. Irklar
arasında polimorfik allel frekanslarında fark olabildiğinden
bütün aileler için optimal olan markör
yoktur. Bazı markörlerin kullanımı ise “linkage
disequlibrium” ile kısıtlanmaktadır. Eğer geniçi
markörler informatif değilse gendışı RFLP ler de
kullanılabilir. FVIII geni için sıklıkla kullanılan
St14 (DXS52) lokusunda kadınların hemen hemen
informatiftir. Gendışı markörlerin kullanımında
polimorfik markör ile gendeki mutasyon arasında
rekombinasyon olasılığı (yaklaşık %5) gendışı markör
kullanımını önemli ölçüde kısıtlar.
Sonuç olarak DNA bağlantı analizi kullanılarak
test edilen kadınların %95’ine tanı verilebilmektedir.
DNA eldesi için fetal örnekler 10-14 haftada
koryonik villus biyopsisi veya 10-20 haftalar arasında
amniyosentez ile yapılmaktadır.
Hastanın tek olduğu ailelerde DNA polimorfizmleri
ile taşıyıcıların saptanması çok kesin değildir.
Bu durumda DNA bağlantı analizi ile annenin taşıyıcı
olmadığı (exclusion analysis) söylenebilir ama
taşıyıcı olduğu veya erkek bir fetüsün hasta olacağı
söylenemez. FVIII mutasyonları erkek gametogenez
de 3.6 katı daha sıklıkla görüldüğü için, hemofili
A annelerinin %85’i taşıyıcıdır. Böyle bir belirsizlik
olduğu için bu ailelere genetik danışmanlık verilirken
plasma FVIII düzeyine bakılır. Genellikle
heterozigot taşıyıcıların FVIII düzeyleri homozigot
normal bireyler ve hemofilik bireylerin FVIII düzeyleri
arasında bir değerdir. Ancak, FVIII aktivitesi
birçok etkene bağlı olarak değişkendir. Örneğin, Xinaktivasyonu,
bazı fizyolojik şartlarda geçici veya
uzun süreli yükselmeler. Genetik analizler, normal
erkeklerde bile FVIII düzeyinin farklı olmasına yol
açan normal FVIII alellerinin veya gene yakın başka
bölgelerin olduğunu düşündürmektedir. FVIII düzeyini
etkileyen gene bağlı olmayan örneğin ABO kan
grubu bölgesi gibi bölgeler de vardır.
Hemofili B’de taşıyıcıların belirlenmesi ve
doğum öncesi tanı hemofili A’ya benzerlik gösterir.
Polimorfik markerlar arasındaki kuvvetli bağ, bazı
markörlerin kullanımını kısıtlar. Bu markörlerin
kullanımı etnik gruplar arasında da önemli farklar
oluşturur. FIX mutasyonları hemen hemen her
hastada saptanabilmektedir. Doğum öncesi tanıda
da bu yöntem uygulanabilir ve böylece kesin tanı
sağlanmış olur.

CiwCiw · #6 27.04.08, 22:51

Hemofilide Gen Tedavisi

Gen transfer yöntemlerindeki gelişmeler, genin
kendi kontrol kaseti ile transferinin giderek önem
kazandığını göstermektedir. Yeni moleküler yaklaşımlar
ile RNA moleküllerinin kullanımı ile farede
FVIII geninin mutasyon taşıyan bölgesi tamir edilebilmektedir
(spliceosome mediated RNA transsplicing,
SmaRT) (3).

CiwCiw · #7 27.04.08, 22:52

Sonuç

Hemofili moleküler genetiği alanında yapılan
çalışmalar hemofili B’lerin hemen hepsinde,
hemofili A’ların da büyük çoğunluğunda sırasıyla
FIX ve FVIII genlerinde mutasyonların saptanabildiğini
göstermiştir. Bir hemofili hastasının mutasyonun
bilinmesi i) ailesindeki taşıyıcıların kesin
olarak belirlenebilmesi ve kesin doğum öncesi tanı
yapılabilmesi için ii) inhibitör oluşumu hakkında
bilgi verebildiği için tedavi stratejisinin saptanması
açısından iii) ilerde geliştirilecek gen tedavisi
yöntemlerin uygulanabilmesi için büyük önem
taşımaktadır.
Türk hastalarında mutasyon profillerinin
hemofili A ve hemofili B veritabanlarına göre bazı
farklılıklar taşımasının ne derece önemli olduğu
ve populasyonların genotipik farklılığından mı
kaynaklandığı daha çok sayıda hastada moleküler
patolojinin çalışılması ile mümkündür.

Kaynak pdf

Seçenekler
Yazdırılabilir şekli göster Sayfayı E-Mail olarak gönder
Stil
Normal Hybrid-Şeklinde gösterime geç Ağaç şeklinde gösterime geç